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L'utilisation des antibiotiques est un procédé curatif très courant (parfois trop), utilisé contre les infections microbiennes. La désinfection d'agents pathogènes est précédée d'études portant sur l'action des antibiotiques à l'égard des bactéries. Les micro-organismes possèdent naturellement une résistance à un sous dosage en antibiotique. Il existe une concentration minimale en antibiotique, relative à chaque espèce microbienne, à partir de laquelle il est possible d'inhiber les organismes. Cette concentration seuil est appelée la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), c'est un critère essentiel à la détermination de la posologie d'un antibiotique.En ce qui concerne la détermination de la CMI d'un antibiotique sur un organisme, les méthodes de mesures se révèlent fastidieuses à mettre en place, et possèdent une faible résolution. Ces méthodes ont très peu évolué depuis leur création, seules des machineries automatisées ont pu faciliter les manipulations. L'utilisation de ces outils révèle que la CMI d'un antibiotique sur un organisme, dépend de la densité initiale de la population bactérienne. Mais surtout que cette dépendance n'est pas linéaire.

Au cours de ma thèse, nous avons développé un procédé expérimental permettant de mesurer la CMI d'un antibiotique. Le dispositif est fondé sur l'utilisation de la milli-fluidique pour concevoir des gouttes d'émulsion, qui sont les échantillons de mesures gérés de manière automatisée. L'utilisation de cette méthodologie a été réservée à la conception d'un gradient de concentration en antibiotique. Chaque échantillon, d'un train d'un millier de gouttes, contenant une quantité en antibiotique différente de sa voisine.Ce procédé donne la faculté de simplifier l'échantillonnage par rapport aux méthodes usuelles. Il permet de contrôler de manière précise l'environnement direct des cellules, et également d'identifier chaque échantillon. Donnant ainsi la capacité d'observer la dynamique de croissance dans les gouttes, et l'influence des paramètres environnementaux. La machine ainsi utilisée a permis d'affirmer et de compléter les informations de dépendance non linéaire entre la CMI et la densité initiale de cellules pour un couple antibiotique/bactérie.

Nous avons mis au point un système expérimental modèle d'adhésion spécifique entre deux surfaces fluides sur lesquelles diffusent des protéines de type ligand-récepteur. Nous avons notamment voulu relier la mesure d'une énergie d'adhésion macroscopique à son moteur microscopique, la formation de liens spécifiques. Pour mesurer une énergie macroscopique d'adhésion, nous avons utilisé des gouttelettes d'émulsion. Lorsqu'elles adhèrent, les gouttelettes se déforment. Le gain de surface permet d'accéder à l'énergie d'adhésion. Comme moteur de l'adhésion spécifique, nous avons utilisé le couple modèle streptavidine/biotine. Les gouttelettes d'émulsion sont fonctionnalisées avec ces protéines ligantes. Amenées par gravité en présence de bicouches lipidiques supportées fluides dont une fraction des lipides porte les protéines réceptrices, les gouttelettes adhèrent spécifiquement aux bicouches lipidiques. Nous avons mené une étude statique de cette adhésion. Grâce à différentes techniques de fluorescence (épifluorescence, FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy), dosages en retour) nous avons quantifié le nombre de protéines mises en jeu dans nos patches adhésifs afin de le comparer à l'énergie de déformation de la goutte. Nous avons pu observer que l'énergie d'adhésion est proportionnelle à l'énergie d'un lien. Par ailleurs, des mesures en RICM (Reflection Iterference Contrast Microscopy) nous ont permis d'étudier la dynamique de croissance du patch adhésif. Nous avons pu mettre en évidence une croissance diffusive et quasistatique de la zone de contact. En jouant sur les quantités de protéines mises en jeu ainsi que sur leur nature (longueur des liens), nous avons exploré les différentes situations statiques et dynamiques de l'adhésion dans notre système modèle. Nous avons notamment mis en évidence les effets de compressibilité des films adhésifs qui apportent de nouvelles clés pour envisager l'adhésion cellulaire.

We present a novel millifluidic droplet analyser (MDA) for precisely monitoring the dynamics of microbial populations over multiple generations in numerous (>10³) aqueous emulsion droplets (~100 nL). As a first application, we measure the growth rate of a bacterial strain and determine the minimal inhibitory concentration (MIC) for the antibiotic cefotaxime by incubating bacteria in a fine gradient of antibiotic concentrations. The detection of cell activity is based on the automated detection of an epifluorescent signal that allows the monitoring of microbial populations up to a size of ~10⁶ cells. We believe that this device is helpful for the study of population dynamic consequences of microbe-environment interactions and of individual cell differences. Moreover, the fluidic machine may improve clinical tests, as it simplifies, automates and miniaturizes the screening of numerous microbial populations that grow and evolve in compartments with a finely tuned composition.

Lipid nanoparticles (LNP) have been designed based on low cost and human-use approved excipients, and manufactured by an easy, robust, and up-scalable process. Fluid colloidal dispersions or gel viscous formulations of highly stable nanoparticles (more than 12 month stability is achieved for some formulations) can be obtained. Their physicochemical properties are studied by Dynamic Light Scattering, Differential Scanning Calorimetry, and NMR. The results picture nanoparticles with a non-crystalline core, which viscosity can be finely tuned by the lipid composition and the temperature. A design of experiments has been used to investigate the limits of the system colloidal stability. The impact of core and surfactant weight fractions have been explored both experimentally and using the design of experiments. The versatility of this physicochemical system could open the way to a wide range of future pharmaceutical applications.

Liquid pearls designate liquid core capsules having a thin elastic shell.

Water-in-oil emulsion drops are formed and stabilized with phospholipids which can adhere and form a bilayer. Using microfluidics, adhesive drop pairs are then trapped and submitted to an ac electric field. We observe three distinct states as a function of the adhesion energy and the electric field intensity. The pair can be either stable, though slightly deformed, or unzip and separate, or coalesce. The frontiers between the different states directly reflect vesicle detachment forces and electroporation theories. The experimental approach that we propose for probing liquid interface wetting between monolayers allows us to finely tuned the tension in the bilayer and gives access to bilayer unzipping.

We introduce an approach for forming bilayer polymer membranes by adhesion of amphiphile-laden interfaces. This adhesion is induced by a reduction of solvent quality for the amphiphilic diblock copolymers through selective evaporation of good solvent in the solvent mixture. By combining this membrane formation mechanism with a double-emulsion-templated approach for vesicle formation, we fabricate monodisperse polymersomes that exhibit excellent membrane uniformity, and structural stability, using a method that has high encapsulation efficiency. Moreover, we also show that the technique is versatile and can be applied to different block copolymers. The ability to direct the assembly of amphiphiles into a membrane creates new opportunities to engineer the structures of vesicles on the level  of the individual bilayer leaflets.

The phase inversion that undergoes an emulsion while being sheared is a sudden phenomenon that is still puzzling. In this Letter, we report an experimental investigation on propagative coalescence by using a microfluidic device where a calibrated two-dimensional emulsion is created and destabilized. The velocity of propagation and the probability of the coalescence are reported as a function of the size and the spatial distribution of the drops, respectively. We then discuss the efficiency of this novel scenario of phase inversion and suggest that inversion can be favored by the existence of a drop size distribution.

The polymerization of actin in filaments generates forces that play a pivotal role in many cellular processes. We introduce a novel technique to determine the force-velocity relation when a few independent anchored filaments grow between magnetic colloidal particles. When a magnetic field is applied, the colloidal particles assemble into chains under controlled loading or spacing. As the filaments elongate, the beads separate, allowing the force-velocity curve to be precisely measured. In the widely accepted Brownian ratchet model, the transduced force is associated with the slowing down of the on-rate polymerization. Unexpectedly, in our experiments, filaments are shown to grow at the same rate as when they are free in solution. However, as they elongate, filaments are more confined in the interspace between beads. Higher repulsive forces result from this higher confinement, which is associated with a lower entropy. In this mechanism, the production of force is not controlled by the polymerization rate, but is a consequence of the restriction of filaments' orientational fluctuations at their attachment point.

Practical and theoretical considerations that apply when aiming to formulate by ultrasonication very small nanoemulsions (particle diameter up to 150 nm) with very high stability are presented and discussed. The droplet size evolution during sonication can be described by a monoexponential function of the sonication time, the characteristic time scale depending essentially on the applied power. A unique master curve is obtained when plotting the mean diameter size evolution as a function of sonication energy. We then show that Ostwald ripening remains the main destabilization mechanism whereas coalescence can be easily prevented due to the nanometric size of droplets. The incorporation of “trapped species” within the droplet interior is able to counteract Ostwald ripening, and this concept can be extended to the membrane compartment. We finally clarify that nanoemulsions are not thermodynamically stable systems, even in the case where their composition lies very close to the demixing line of a thermodynamically stable microemulsion domain. However, as exemplified in the present work, nanoemulsion systems can present very long-term kinetic stability.

Les travaux accomplis au cours de cette thèse au Laboratoire de Colloïdes et Matériaux Divisés résultent d'une volonté de développer et d'utiliser des outils physico-chimiques pour la compréhension de problématiques biologiques. Nous avons choisi comme objet d'étude ce champignon unicellulaire extraordinaire qu'est la levure Saccharomyces cerevisiae. En particulier nous nous sommes intéressés à la fermentation alcoolique à travers la mesure d'un des paramètres du métabolisme : l'énergie de maintenance. Les résultats obtenus s'articulent autour de deux réalisations principales. *** Développement d'un outil de mesure original : Nous avons mis au point un système physico-chimique qui permet de mesurer la polymérisation ou la dépolymérisation au sein de microréservoirs de quelques dizaines de picolitres . Le principe repose sur l'osmose, c'est-à-dire la di usion, à travers une membrane semi-perméable, de solvant entre des réservoirs qui possèdent des potentiels chimiques di érents. Pour réaliser ce système nous avons fabriqué un réseau de gouttes d'émulsion inverse qui constituent des microréservoirs dans lesquels nous avons encapsulé les levures. Les gouttes ont été organisées en un réseau bi-dimensionnel qui nous a permis de suivre des cinétiques de croissance sur un grand nombre d'échantillons (haut débit). Nous avons alors élaboré une nouvelle formulation de l'émulsion afin de rendre les gouttes adhésives entre elles. Ceci nous a permis d'imposer les dimensions et les propriétés de transport à l'intérieur des membranes semi-perméables ainsi formées entre les gouttes en contact. Nous avons alors démontré qu'en imposant des potentiels chimiques constants dans le réseau de gouttes, nous pouvions suivre, à travers l'évolution de leur volumes, la cinétique de processus de polymérisation (création de biomasse dans le cas de la levure) et de dépolymérisation (dans le cas de la lyse enzymatique) qui ont lieu dans des réservoirs. *** Mesure directe de l'énergie de maintenance : Nous avons utilisé notre outil pour mesurer la consommation du glucose par S. cerevisiae lors de la fermentation alcoolique en milieu anaérobie. Nous avons ainsi distingué deux comportements suivant que les cellules se divisent ou qu'elles sont en phase stationnaire. Nous avons développé un modèle qui nous a permis d'expliquer les comportements observés en fonction des paramètres expérimentaux (concentration en sucre, transport) et du métabolisme de la levure. Nous nous sommes alors rendu compte qu'en imposant le réactif limitant nous pouvions mesurer l'énergie de maintenance, c'est-à-dire l'énergie qui n'est pas utilisée pour la division cellulaire. Nous avons enfin mesuré le taux de consommation de glucose pour trois souches différentes. Nous avons ainsi montrer qu'il était possible d'identifier des souches selon leur capacité à métaboliser le glucose. Nous nous sommes alors interrogés sur la possibilité de cribler à haut débit des souches capables de métaboliser des sucres différents. Aussi, nous pouvons envisager, pour augmenter la taille de la librairie à trier, une approche 3D. Les gouttes sont collectées dans une seringue dans laquelle le mûrissement entre les gouttes se produit. Elles sont alors réinjectées dans un microsystème contenant une centaine de zones de tri. Avec un débit d'injection des gouttes de 10kHz, sachant qu'une goutte sur 10 contient une levure, on peut alors cribler une librairie de 108 individus différents en moins de 30 minutes. *** Au total : Le principe de mûrissement des gouttes développé dans cette thèse peut s'appliquer à tout processus qui se traduit par une modification du nombre d'espèces osmotiquement actives. On peut donc envisager de l'utiliser pour un champ vaste d'applications telle que la recherche de nouvelles enzymes de protéolyse. Enfin, nous aimerions attirer l'attention du lecteur sur l'aspect statistique de cette méthode. Elle offre la possibilité d'étudier des processus de sécrétion ou d'assimilation de plusieurs milliers d'individus isolés. Ainsi, des questions telles que la variabilité entre individus vont pouvoir être abordées.

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Les tests de diagnostic ont pour but de détecter et de quantifier un ou plusieurs analytes en milieu complexe. Depuis les années 80, leur évolution s'est concentrée sur la détection de très faibles quantités d'analytes. Actuellement, cette ligne directrice subsiste mais en parallèle les développements se portent sur de nouveaux objectifs comme la mise au point de tests simples, rapides, transportables et sensibles afin de répondre au mieux aux attentes des nouveaux marchés : le point of care et les pays émergents. Au cours de ce travail, nous nous sommes confrontés à ces nouvelles problématiques. Nous avons choisi d'améliorer la sensibilité du test d'agglutination magnétique précédemment développé au laboratoire en raison de sa simplicité (test homogène) et de sa rapidité (manipulation de billes magnétiques). Nous avons montré que deux paramètres conditionnaient le seuil de détection de ce test à savoir le bruit (variabilité du signal sans antigène) et le signal émis par les billes. Le premier facteur dépend principalement du nombre de billes et le deuxième nous a amené à travailler avec de grandes billes nécessitant une nouvelle méthode de détection, la cytométrie en flux. Le gain en sensibilité n'a pas été clairement démontré en raison de la très faible réactivité des billes utilisées (500 fois moins réactives que les billes "habituelles"). Une chose est sûre, de grandes billes améliorent le signal, la cinétique et la thermodynamique au détriment d'une plus faible mobilité des objets sous champ. Sous couvert d'une bonne réactivité, nous nous sommes aperçus que la première étape de notre test d'agglutination devenait thermodynamiquement et cinétiquement limitante aux faibles concentrations en analyte. Dans le cadre du projet européen DetectHIV, nous avons essayé d'une part de franchir ces barrières à travers un système microfluidique et d'autre part de mettre au point un test complètement intégré. De nouvelles technologies ont vu le jour à l'EPFL (plug magnétique) et à DTU (cytométrie sur puce). Le système développé par l'EPFL est thermodynamiquement favorable, valide l'idée de préconcentration mais nécessiterait un nouveau dimensionnement fluidique pour réellement supplanter les tests en volume. L'intégration, quant à elle, a permis d'acquérir un certain savoir faire dans le domaine de la microfluidique, d'identifier les verrous technologiques et de développer un nouveau mode de circulation des fluides. Pour conclure, ce travail a permis de cerner l'évolution possible des tests d'agglutination magnétique. La sensibilité du test originel c'est-à-dire en volume couplé à une détection turbidimétrique est fixée par le bruit de l'appareil de mesure. Ce paramètre étant peu optimisable, seule une augmentation de la taille des billes permettrait d'augmenter significativement la sensibilité du test (un facteur 10 en théorie). Au delà, une détection individuelle des objets via la cytométrie est nécessaire. D'une part, elle permet de travailler avec de gros objets afin d'amplifier grandement le signal et d'autre part, elle permet de s'affranchir du bruit de l'appareil de mesure. Le bruit mesuré est uniquement dû à la comptabilisation des populations, bruit inhérent au test de diagnostic. Avec cette configuration, un gain de sensibilité passe par une diminution du non-spécifique (relatif au comptage des populations) et par une augmentation de la réactivité des "grosses" billes. En dessous de la dizaine de femtomoles, la formation de complexe n'est plus assurée et devient longue, un changement de format fluidique est alors nécessaire. Le nouveau format fluidique testé, la microfluidique, s'avère très prometteur à condition d'intégrer une méthode de détection (cytométrique ou autre) et d'augmenter les débits.

The invention describes a method for isolating one or more genetic elements encoding a gene product having a desired activity, comprising the steps of: (a) compartmentalising genetic elements into microcapsules; and (b) sorting the genetic elements which express the gene product having the desired activity; wherein at least one step is under microfluidic control. The invention enables the in vitro evolution of nucleic acids and proteins by repeated mutagenesis and iterative applications of the method of the invention.